mikrobiologi ( pewarnaan)

PENDAHULUAN

 

 

1.1  Latar Belakang

Bakteri merupakan organisme yang memiliki morfologi bentuk tubuh dasar yang pada umumnya mirip satu sama lain dengan struktur tambahan yang berbeda-beda. Sel bakteri jika diamati dengan mata biasa sangatlah sulit karena ukurunnya yang sangat mikroskopik, untuk itu digunakan mikroskop untuk membantu dalam  mengamati morfologi dan mengidentifikasinya.

Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat karena bentuk selnya yang transparan dan bermacam-macam. Bakteri juga memiliki sifat yang dapat diabsorbsi oleh zat-zat tertentu. Dalam laboratorium mikrobiologi sifat-sifat tersebut digunakan untuk mengamati bakteri, karena sifat yang dapat menyerap suatu zat yang bersifat asam atau basa yang dapat memberikan suatu warna baik itu pada sel bakteri ataupun pada latar belakang dari bakteri tersebut.

Pewarnaan dalam kegiatan identifikasi bakteri bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Di mana zat warna tersebut dapat memberikan muatan negatif atau positif.  Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, dan Malachite Green. Sedangkan zat warna basa sebagai contoh antara lain Eosin dan Congo Red .

Berdasarkan hal di atas maka, dilakukanlah percobaan ini untuk mengetahui dari bagaimana cara kerja dari suatu zat warna dan sifatnya pada suatu bakteri.

 

1.2  Tujuan Praktikum

1.        Mengatahui tujuan dari pewarnaan bakteri.

2.        Mengetahui bentuk morfologi dari bakteri yang telah diwarnai dengan zat warna.

3.        Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi dari perwarnaan bakteri.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

 

 

Mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak transparan bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa. Hal ini karena sitoplasma sel mikroba memiliki indeks bias hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair dan mikroba tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya.

Pada umumnya zat warna yang digunakan adalah senyawa-senyawa garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion yang bermuatan negatif. Sel-sel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati netral. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif dari ion zat warna, misalnya methylen blue, sehingga hasilnya sel tersebut akan berwarna. Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroba dinamakan perwarnaan positif. Dalam prosedur ini dapat digunakan zat warna basa yang bermuatan positif maupun zat warna yang bermuatan negatif. Zat warna atau zat biologi adalah persenyawaan organik yang mempunyai gugus cromofor dan gugusan auxocrom yang berikatan dalam suatu cicin benzena. Gugus cromofor merupakan gugusan yang dapat memberikan warna pada molekul cat, sedangkan auxocrom adalah zat yang dapat memberikan disosiasi elektrolit-elektrolit pada molekul cat sehingga cat bersifat lebih mudah bereaksi (Waluyo, 2008).

Perwarnaan sederhana merupakan pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan yang sudah difiksasi. Pewarnaan diferensial merupakan teknik dari prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba. Dengan teknik ini biasanya digunakan lebih dari satu larutan zat pewarna atau reagen pewarnaan.

Pewarnaan gram merupakan salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan gram. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi 2 kelompok: salah satu di antaranya bakteri gram positif, mempertahankan zat pewarna Kristal violet dan karenanya tampak ungu tua. Gram negatif kehilangan Kristal violet ketika dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi pewarnaan tandingan dengan merah safranin, tampak merah (Dwidjoseputro, 1981).  

Organisme penyebab gastroenteritis (Enterokolitis)

1)      Bakteri Gram Positif

a.       Staphylococcus aereus

Selnya berbentuk bola dengan garis tengah 0,8-leam tersusun dalam kelompok-kelompok tidak teratur. Di bawah pengaruh zat-zat kimia tertentu (misalnya penicillin) kuman ini berubah bentuk menjadi L, tetapi kuman tidak dipengaruhi oleh garam-garam empedu atau optokin. Kuman ini bersifat koogulasi positif, berwarna kuning, bersifat hemolisa positif dan meragikan manitol.

b.      Bacillus cereus

Bakteri ini termasuk batang besar, gram positif, membentuk rantai, membentuk spora, dapat tumbuh pada makanan dan menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan kracunan makanan.

2)      Bakteri Gram Negatif

Escherichia coli

Bakteri ini berbentuk batang gram negative yang dapat membentuk rantai, jarang membentuk spora. Pada umumnya tidak dapat memproduksi H₂S, tetapi beberapa strain mendapatkan plasmid dari Salmonella sehingga mampu memproduksi gas ini. Sporanya mudah dirusak oleh panas, germisida dan disinfektan pada konsentrasi rendah. Mempunyai sejumlah fimbrae atau pili sebagai alat melekat pada host (Budiyanto, 2002).

Perwarnaan sel pada mikroorganisme pada umumnya menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Hasil pewarnaan tergantung beberapa faktor antara lain:

1.        Fiksasi

Sebelum mikroorganisme, khususnya bakteri diwarnai harus dilakukan fiksasi terlebih dahulu. Cara yang paling banyak digunakan adalah cara fisik dengan pemansan  atau dengan freeze drying atau dapat juga dilakukan fiksasi dengan melakukan agensia kimia. Agen kimia yang sering digunakan antara lain sabun, fenol, dan formalin.

Cara fiksasi yang paling banyak digunakan dalam pewarnaan bakteri adalah dengan membuat lapisan suspensi dari atas gelas beberapa kali di atas nyala lampu spirtus. Pewarnaan biologi lainya dapat digunakan agensia-agensia fiksasi kimia seperti campuran asam cuka dengan asam pikrat, alkohol dengan aseton, asam kromat dengan asam osmiat.

2.        Peluntur Zat Warna

Peluntur zat warna adalah suatu senyawa yang menghilangkan warna dari sel yang diwarnai. Peluntur zat warna berfungsi untuk menghasilkan kontrras yang baik pada bayangan mikroskop. Pada umumnya sel-sel yang mudah diwarnai akan lebih mudah pula dilunturkan. Sedangkan sel-sel yang sukar diwarnai akan lebih sulit dilunturkan warnanya. Adanya variasi di dalam kecepatan dekolorasi (peluntur) zat warna inilah yang digunakan untuk membedakan berbagai macam jenis bakteri dala pewarnaan gram atau pewarnaan bertingkat (diferensial).

Ada beberapa mazam peluntur zat warna:

a.       Peluntur zat warna bersifat asam, yakni HNO₃, HCl, H₂SO₄, dan campuran asam-asam terssebut dengan alkohol.

b.      Peluntur warna bersifat basa, yakni KOH, NaOH, sabun, dan garam-garam basa.

c.       Peluntur zat warna yang lemah, yaitu alkohol, air, minyak, minyak cengkeh, aseton, dan gliserin.

d.      Garam-garam logam berat: AgNO₃, CuSO₄.

e.       Garam-garam logam ringan, Na₂SO₄, MgSO_4.

3.        Intensifikasi Pewarnaan

Zat warna dapat diintensifkan dengan beberapa cara misalnya mempertinggi kadar zat warna (60-90⁰C) dan menambahkan suatu mordan. Mordan adalah suatu zat kimia yang dapat menyebabkan sel-sel mikroba dapat diwarnai lebih intensif atau menyebabkan zat warna terikat lebih kuat pada jaringan sel bila dibandingkan dengan cara pewarnaan diberi mordan. Ada beberapa mordan antara lain, mordan basa yatiu, mordan yang bereaksi dengan anion zat zat warna asam yang berwarna, seprti FeSO₄, kalium, antimonium tartrat, dan asetil piridinium klorida. Mordan asam yaitu, mordan yang bereaksi dengan zat-zat warna basa. Zat warna ini misalnya asam tanin, asam pikrat (Waluyo, 2008). 

Pewarnaan bakteri

Oleh kerena perbedaan indeks biasan antara bakteri dan kawasan sekelilingnya tidak besar, maka jurang perbezaan optikalnya juga adalah sedemikian. Keadaan ini mengakibatkan sel bakteri sukar untuk diamati. Tambahan pula, perbedaan indeks biasan yang kecil antara komponen-komponen sel bakteri juga menyulitkan substruktur bakteri untuk dilihat. Sebagai langkah untuk mengatasi masalah ini perbedaan warna digunakan untuk memudahkan melihat keseluruhan sel bakteri dan juga untuk mempamerkan substruktur bakteri dan segala-galanya mengenai bakteri dengan lebih terperinci. Pewarnaan juga digunakan untuk menunjukkan taburan dan jenis kimia berbagai-bagai komponen sel serta membedakanantara golongan-golongan bakteri.

Pewarna dan Jenis Pewarnaan

Bahan pewarna boleh dibagikan kepada dua golongan: pewarna acid dan pewarna bes. Pada pewarna acid, ciri pewarnaan adalah bergantung kepada anion (ion negatif) dan pada pewarna basa, ciri pewarnaan bergantung kepada kationnya (ion positif). Pewarna yang digunakan, umumnya, berasal daripada terbitan garam acid bebas kerena bentuk ini lebih larut, mampu menyusup masuk ke dalam sel dengan lebih baik dan pewarnaannya lebih kekal. Bakteri menunjukkan kecenderungan atau afiniti yang kuat terhadap pewarna basa (contoh: safranin, metilena biru, kristal ungu) kerana protoplasma bakteri mempunyai kandungan acid nukleat berkas negatif yang tinggi. Apabila diwarnakan dengan pewarna basa, cat yang negatif ini akan bertindak dengan ion positif pewarna basa. Sebaliknya cat negatif ini akan menolak pewarna acid, dengan demikian hanya latar belakang (kawasan di luar bakteri) saja yang diwarnai. Apabila sel bakteri diwarnakan dengan satu jenis pewarna saja, pewarnaan ini disebut pewarnaan sederhana (simple staining).

Pada umumnya dalam pewarnaan ini, keseluruhan sel bakteri diwarnakan secara sama rata dan substruktur atau komponen-komponen selnya tidak dibedakan. Untuk menunjukkan perbedaan yang wujud di kalangan sel bakteri tertentu, tata cara pewarnaan perbedaan yang menggunakan dua atau lebih pewarna digunakan. Intensiti pewarnaan boleh dipertingkatkan (ataupun supaya sasaran dapat diwarnakan) dengan menggunakan haba dalam keadaan tertentu atau menggunakan bahan kimia (aksentuator) seperti acid asetik, fenol atau anilin. Tindakan aksentuator ini tidak melibatkan pergabungannya dengan pewarna seperti yang berlaku pada mordan.

Mordan adalah bahan kimia yang membolehkan sesuatu pewarna mewarnai sesuatu bahan, atau mordan mempertingkatkan afiniti ataupun kecenderungan pewarna terhadap struktur tertentu. Pewarnaan yang diterangkan setakat ini dikenal sebagai pewarnaan positif kerena yang diwarnai ialah bakteri. Dalam pewarnaan negatif, satu film pewarna gelap meliputi ruang dan celah di antara bakteri-bakteri (latar belakang) dan bakteri tidak diwarnakan. Perlu disadari bahawa ciri-ciri pewarnaan bakteri (serta morfologi) dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti umur kultur dan sumber bakteri, yaitu sama ada berasal daripada spesimen klinikal atau dari kultur pertumbuhan.

 

 

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram adalah tata cara pewarnaan utama di bidang bakteriologi. Di samping membolehkan bakteri dilihat dengan lebih mudah, pewarnaan ini juga digunakan untuk menggolongkan bakteri. Dalam tata cara pewarnaan Gram, pewarna digunakan secara berlebihan dan kemudian agen penghapus warna atau pembeda digunakan untuk menghilangkan pewarna berkenaan. Bakteri yang mengekalkan pewarna pertama (kristal ungu) disebut sebagai Gram-positif, manakala yang kehilangan pewarna ini dan diwarnai dengan pewarna kedua dinyatakan sebagai Gram-negatif. Larutan iodin Lugol yang digunakan berfungsi sebagai mordan dan pelarut organik seperti alkohol dan aseton digunakan sebagai

pembeda. Pewarna yang digunakan untuk menggantikan pewarna pertama yang dihilangkan oleh pembeza disebut pewarna balas (counter stain). Hasil tindak balas pewarnaan Gram adalah bergantung kepada komposisi dinding sel bakteri yang berkemampuan untuk mengikat pewarna pertama atau tidak. Protoplasma bakteri, dalam hal ini, sentiasa memberikan tindak balas Gram-negatif (Leong, dkk, 1999).

BAB III

METODE KERJA

 

 

3.1 Waktu dan Tempat

            Praktikum tentang pewarnaan dan cara perwarnaan ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Mulawarman pada hari Senin tanggal 22 Maret 2010, pukul 13.00 Wita sampai selesai.

 

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat-alat

1.      Objek gelas

2.      Pipet tetes

3.      Mikroskop

4.      Bunsen burner

5.      Jarum ose

3.2.2 Bahan-bahan

1.      Kristal violet

2.      Alkohol 95%

3.      NaCl

4.      Biakan Staphycoccus aerus

5.      Tinta cicin

6.      Safranin

7.      Lugol’s Iodine

8.      Aquades

 

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Pewarnaan sederhana

1.      Dibersihkan objek gelas dari lemak dengan menggunakan alkohol.

2.      Diambil jarum ose, kemudian sterilkan dengan menggunakan bunsen burner.

3.      Diambil media biakan, setelah itu diambil suspensi bakteri dengan perlahan.

4.      Diratakan suspensi yang telah diambil pada gelas objek.

5.      Kemudian diangin-anginkan, lalu diteteskan NaCl 1 tetes, kemudian dikeringkan anginkan.

6.      Kemudian difiksasi diatas lampu Bunsen.

7.      Setelah itu didinginkan dan ditetesi dengan zat warna Kristal violet sebanyak 1 atau 2 tetes.

8.      Kemudian dibiarkan 1-2 menit agar kering.

9.      Setelah itu dicuci dengan air yang mengalir sampai zat warna tercuci. Kemudian dikering anginkan .

10.  Setelah kering preparat diamati di bawah mikroskop.

11.  Digambar bakteri yang tampak pada preparat.

 

3.3.2    Pewarnaan Negatif

1.          Dibersihkan objek gelas dari lemak dengan menggunakan alkohol dan dihangat-hangatkan diatas lampu Bunsen.

2.          Diambil jarum ose, kemudian sterilkan dengan menggunakan bunsen burner.

3.          Diambil media biakan, setelah itu diambil suspensi bakteri dengan perlahan.

4.          Diratakan suspensi yang telah diambil pada gelas objek.

5.          Kemudian diangin-anginkan, lalu diteteskan NaCl 1 tetes, kemudian dikeringkan anginkan.

6.          Diteteskan zat warna tinta cina sebanyak 1 atau 2 tetes, kemudian diratakan dengan objek gelas

7.          Kemudian dikeringkan anginkan.

8.          Setelah itu diamati di bawah mikroskop dan digambar sel-sel bakteri yang didapat.

 

 

3.3.3        Pewarnaan Gram

1.      Dibersihkan objek gelas dari lemak dengan menggunakan alkohol 95%.

2.      Diambil jarum ose, kemudian sterilkan dengan menggunakan bunsen burner.

3.      Diambil media biakan, setelah itu diambil suspensi bakteri dengan perlahan.

4.      Diratakan suspensi yang telah diambil pada gelas objek dan difiksasi di atas lampu bunsen.

5.      Diteteskan NaCl 2 tetes, kemudian dikering anginkan.

6.      Setelah kering, diteteskan lagi zat warna utama berupa Kristal violet sebanyak 1-2 tetes diamkan selama 1 menit.

7.      Kemudian dicuci dengan alkohol 95% selama 30 detik.

8.      Setelah itu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.

9.      Kemudian di teteskan lagi dengan zat warna safranin sebanyak 2 tetes.

10.  Setelah itu cuci kembali  dengan air yang mengalir dan dikeringkan dengan dianginkan.

11.  Setelah itu diamati di bawah mikroskop dan digambar bentuk sel-sel bakteri yang tampak.

4.2 Pembahasan

            Metode pewarnaan sederhana suatu metode pewarnaan umum dimana dapat digunakan beberapa larutan tunggal zat warna (zat warna tunggal) dengan tujuan untuk melihat bentuk-bentuk sel bakteri. Dalam pewarnaan ini digunakan pewarna Kristal violet, dimana bakteri yang diwarnai akan berwarna ungu (violet). Tujuan dari pewarnaan sederhana adalah memberikan warna gelap pada bakteri sehingga bentuk sel dapat terlihat jelas.

            Metode pewarnaan negatif suatu metode pewarnaan umum dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri melainkan hanya latar belakangnya saja,  sehingga hanya kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk yang kosong tidak berwarna (negatif). Pengecatan negatif ini sangat berguna untuk melihat bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya, selain itu juga berguna untuk mengukur (pengukuran) bakteri, karena dalam pewarnaan ini sel-sel bakteri tidak ikut terwarnai oleh zat warna atau tidak mengalami perubahan. Di mana dalam pewarnaan ini sel mikroorganisme akan tampak transparan, sedangkan latar belakngnya akan tampak gelap.

            Pada pewarnaan negatif pada bakteri S. aerus akan terlihat bentuk bakteri yang transparan, berbentuk bola, dalam kelompok yang tidak teratur. Pada pewarnaan ini hanya latar belakangnya saja yang di warnai karena untuk melihat bentuk sel-sel dari bakteri yang terlihat transparan, sebab ada beberapa jenis bakteri yang tidak bisa diwarnai dengan zat warna basa. Dengan mewarnai latar belakangnya saja diharapkan dapat melihat bentuk sel-sel bakteri yang sesungguhnya dan terlihat transparan.

            Metode pewarnaan gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam pewarnaan bakteri, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel kegunaannya yaitu, untuk melihat atau mengamati bentuk-bentuk sel bakteri dan memberikan sifat reaksi pewarnaan bakteri yang dapat diketahui dengan melihat apakah termasuk negatif- gram (berwarna merah) atau positif-gram (berwarna biru).

            Fungsi dari zat warna yang digunakan antara lain:

a.       Safranin berfungsi sebagai zat warna yang memberi warna kontras pada bakteri dengan memberikan warna merah.

b.      Kristal violet yaitu zat warna yang memberikan atau menunjukkan sifat pewarnaan negatif dengan memberikan warna ungu pada bakteri yang peka terhadap zat warna basa.

c.       Zat warna Iodine berfungsi sebagai zat warna pengikat ikatan warna, sehingga warna yang dihasilkan lebih jelas.

d.      Tinta warna berfungsi memberikan warna biru tua atau gelap pada latar belakang dari preparat atau apusan bakteri.

Perbedaan dari bakteri gram negatif dan gram positif yaitu, bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel kegunaannya yaitu, untuk melihat atau mengamati bentuk-bentuk sel bakteri dan memberikan sifat reaksi pewarnaan bakteri yang dapat diketahui dengan melihat apakah termasuk negatif-gram (berwarna merah) atau positif-gram (berwarna biru).

Morfologi dari S. aureus:

            Sel berbentuk bola, berdiameter 0,5 sampai 1,5 µm, terdapat tumggal dan berpasangan dan secara khas membelah diri pada lebih dari satu bidang, sehingga membentuk koloni yang tidak teratur. Merupakan gram positif dengan dinding sel mengandung dua komponen utama peptidoglikan serta asam tekoat. Tumbuh lebih cepat dalam keadaan aerobic dengan suhu optimum 35⁰C-40⁰C, berasosiasi dengan kulit, kelenjar kulit dan selaput lender hewan berdarah panas.

            Bakteri positif memiliki sifat mampu bereaksi dengan zat warna yang bersifat asam, sedangkan bakteri negatif dapat bereaksi dengan zat warna yang bersifat basa. Karena pada zat warna basa memberikan muatan positif dan zat warna asam memberikan muatan negatif.

BAB V

PENUTUP

 

 

5.1 Kesimpulan

            Dari praktikum kali ini diperoleh sebuah kesimpulan yaitu:

1.      Tujuan dari dilakukannya pewarnaa bakteri adalah memudahkan kita melihat mikroba di bawah mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk mikroba, melihat struktur luar dan dalam dari bakteri dan menghasilkan ciri khas dari bakteri dengan zat warna.

2.      Bentuk bateri yang dihasilkan dalam pewarnaa sangat bervariasi sesuai dengan jenis bakteri yang diwarnai, misalnya: bulat, berantai, dan memanjang.

3.      Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri: pembuatan preparasi yang harus diperhatikan, waktu dekolorisasi yang merupakan fase kritis, dan ketelitian dalam melakukan prosedur kerja agar tidak terjadi kesalahan.

 

 

5.2 Saran

            Untuk praktikum selanjutnya agar dapat mengunakan bakteri Bacillus subsutilis, agar bisa membandingkan hasil pewarnaan dan bentuk dari bakteri ini.

DAFTAR PUSTAKA

 

 

Budiyanto, A. K. 2002. Mikrobiologi Terapan. Penerbit Muhammadiyah Malang: Malang.

Dwidjoseputro, D. 1981. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta.

Loeng, Y. K, Abdul H. A. A, Mohm. S. M. Y. 1999. Mikrobiologi Makmal. Penerbit Universiti Kebangsaan Malaysia: Selangor, Malaysia.

Waluyo, Lud. 2008. Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi. UPT. Penerbit UMM: Malang.